Obsah
Nukleové kyseliny
Nukleové kyseliny jsou původem blízké proteinům. Zodpovídají za reprodukci organismů. Působí odlišnosti druhů, díky odlišné produkci bílkovin. Poprvé byly izolovány již roku 1869 panem Mieschner. Ten objevil neznámou látku v jádrech buněk bílých krvinek hnisu. Jejich význam byl ale prokázán až 1944.
Historie objevování nukleových kyselin a genetiky
• 1865 Mendelovy zákony dědičnosti
• 1869 poprvé izolována DNA Mieschnerem z jader buněk hnisu- naznána kyselina nukleová
• 1911 gen jako základní jednotka dědičnosti
• 1943 rentgenová difrakce DNA
• 1952 geny jsou z DNA
• 1953 Watson + Crick – dvojšroubovicová struktura DNA (1962 Nobelova cena)
• 1961 m-RNA přenáší genetickou informaci v buňce
• 1975 sekvenování DNA
• 1977 objev intronů
• 1982 vznik GenBank – databáze přečtené DNA
• 1990 projekt sekvenace lidského genomu HUGO
• 1995 osekvenován první mikrobiální genom Haemofilus influenzae (patogenní bakterie 1,8.106 nukleotidů)
• 1996 osekvenován první eukaryotický genom – kvasinka Saccharomyces cerevisiae
• 1998 osekvenován první mnohobuněčný organismus hlístice Caenorhabtitis sp.
• 1999 osekvenován nejmenší lidský chromozóm 22
• 2000 lidský chromozóm 21, první pracovní verze kompletního lidského genomu
• 2003 finální verze lidského genomu
Funkce a výskyt
Nukleové kyseliny se vyskytují prakticky ve všech buňkách a virech. Ve všech buňkách daného organismu je stejná DNA. Ve struktuře DNA jsou u každého jedince individuální rozdíly. Slouží k úschově a předávání genetické informace.
V kvasinkách tvoří nukleové kyseliny 45% sušiny, u bakterií je to 15% sušiny. U člověka jsou nukleové kyseliny obsaženy nejvíce v brzlíku. Z buněčných organel se vyskytují v jádře, mitochondriích, plastidech a ribozómech. NK určují průběh proteosyntézy, způsobují odlišnost bílkovin a tím i odlišnost druhů. Na základě testů DNA mohou kriminalisté identifikovat podezřelé. DNA získávají například z krve, spermatu, kůže, slin nebo vlasů.
Typy nukleových kyselin
Rozlišujeme dva typy nukleových kyselin, DNA a RNA. DNA je kyselina deoxyribonukleová. Její funkce je uskladnění genetické informace. Vyskytuje se především v jádře, mitochondriích, u rostlin i v chloroplastech. Druhou nukleovou kyselinou je RNA tedy kyselina ribonukleová, která zajišťuje realizaci genetické informace. Vyskytuje se především v cytoplazmě a v ribozómech. Obě kyseliny se liší nejen použitou pentózou, ale i některými bázemi, které jsou schopné vázat. U DNA je cukrem deoxiribóza, přesněji β 2 deoxiribofuranóza, zatímco u RNA je to ribóza, tedy β ribofuranóza. Nukleové kyseliny jsou také tvořeny fosfátem. Na něm dochází při vazbě na cukr k odštěpení vodíku, čímž vzniká záporný náboj na kyslíku, a tento pak dává celé DNA záporný náboj. Díky odštěpování tohoto vodíky jsou to kyseliny.
Struktura nukleových kyselin
Nukleové kyseliny jsou přírodní polymery, označujeme je jako polynukleotidy. Základním kamenem jsou nukleotidy, který je tvořen pentózou, fosfátem a heterocyklickou bází. Není ale pravdou, že nejrozsáhlejší DNA má nejvyspělejší organismus. Nejvyšší genom totiž mají rostliny. Jen pro zajímavost, člověk má 3 . 109 nukleotidů, zatímco bakterie mycoplasma genitalium má pouze 5 . 105 nuklotidů.
Gen je úsek DNA, který řídí syntézu jedné bílkoviny. Soubor všech genů se označuje jako genom. Tento je zodpovědný za syntézu všech proteinů. Genom je tedy dán pořadím, sekvencí (tedy přesným složením), bazí (nukleotidů). U různých lidí je shodná DNA více než 99,9%. Další zajímavostí je, že jen 2% DNA kódují nějaký protein. O funkci většiny DNA se tedy zatím neví.
Primární struktura
Primární struktura je tvořena bází, cukrem a fosfátem. Těmto třem látkám navázaným na sebe se říká nukleotid, chybí-li na nich fosfát (tedy mluvíme pouze o bázi a cukru) pak se jim říká nuklosid. Základními bázemi u DNA jsou adenin, guanin, thymin a cytosin, u RNA jsou to adenin, guanin, thymin a uracil. Podle toho od jaké heterocyklické sloučeniny je odvozujeme, rozlišujeme tyto základní báze na purinové (A,G) a pyrimidinové (C,U,T).
Kromě těchto základních (majoritních) se ale také v některých typem nukleových kyselin vyskytují i minoritní báze. Ty jsou obsaženy především ve struktuře tRNA. Jsou to thiouracil (značíme: τ), pseudouridin (ψ) a dihydrouracil (D).
-
Pseudouridin
-
DIHYDROURACIL
-
THIOURACIL
V názvosloví nukleotidů se používají většinou 3 písmenné zkratky. Když se neuvádí, jaká ribóza je ve struktuře přítomna, je tam vždy ribóza. Pokud tam není ribóza, je to v názvu výslovně napsáno. Název tedy obsahuje názvy báze a počet fosfátů. Na vzorci níže vidíme jeden adenosin a jeden fosfát a proto jej pojmenujeme AMP, jako Adenosinmonofosfát.
Dalšími důležitými nukleotidy jsou ATP, který se uplatňuje jako nejrozsáhlejší zdroj energie, dále cAMP, což je druhý posel, který zajišťuje mezibuněčnou komunikaci.
GTP napomáhá syntéze glykosidických vazeb, CTP se uplatňuje při syntéze složených lipidů.
Zápis nukleotidů je dán konvenčně. Začíná od C 5´ konce k C 3´ konci. Tedy začíná od té ribózy, kde je na 5´ uhlíku navázán substituent, nejčastěji fosfát a končí u té ribózy, kde je na 3´ uhlíku navázán jiný substituent, nejčastěji báze.
Sekundární struktura
Sekundární struktura nukleových kyselin je podobná jako u proteinů. Jako sekundární strukturu označujeme útvar, kdy se 2 polynukleotidové řetězce stáčí do šroubovice, která je ve všech přírodních organismech pravotočivá. Jelikož je tvořena 2 řetězci, označujeme ji jako double-helix. Tvar dvoušroubovice je udržován vodíkovými můstky mezi nukleotidy. Ty jsou umožněny přítomností oxo skupiny a zároveň nějaké kyselé skupiny, poskytující ochotně vodík. Různé nukleotidy mají různý počet vodíkových můstků. Vazební partneři guanin a cytosin spolu mohou tvořit 3 vodíkové můstky, zatímco adenin s uracilem či thyminem pouze 2. Toto je dáno jejich složením a počtem skupin schopných H můstky tvořit. Na základě těchto vazeb mluvíme o tzv. párování bazí. Říkáme o nich, že jsou komplementární, tedy že upřednostňují vazbu na svého vazebného partnera. Obě vlákna nukleotidů jsou k sobě antiparalelní, 3´ a 5´konce jdou proti sobě. Každý úsek DNA je tvořen bázemi podle tohoto rozdělení: 15% z nich tvoří adenin, 15% thymin, 35% cytosin a 35% guanin.
Na šroubovici můžeme pozorovat malý žlábek, který vznikl spojením dvou řetězců H můstky a žlábek velký, který vznikl otáčením šroubovice. DNA má průměr zhruba 2 nm, přesto je její Mr asi 1010 až 1012. Na jednu otočku připadá asi 10 nukleotidů.
Celkem existují 3 popsané struktury DNA. Tyto se vzájemně liší buď množstvím nukleotidů na jednu otáčku, tedy tím jak rychle se otáčejí, nebo tím, do jakého směru se otáčí. Rozlišujeme DNA A, která byla připravena in vitro, tedy v laborce. Na jednu otočku má 11 párů bází, vydrží více manipulace, proto byla také vytvořena. Pracuje se s ní lépe, než s DNA B, která je stejně jako DNA A pravotočivá. DNA B má průměr zhruba 2 nm, její Mr je asi 1010 až 1012. Na jednu otočku připadá asi 10 nukleotidů. Je to ta struktura DNA, která se vyskytuje v živých organismech.
Vzájemně na sebe přecházejí podle koncentrace ethanolu vodného prostředí, ve kterém leží. Její otáčky jsou ale pozvolnější, na jednu otáčku připadá 10 párů bází. Poslední možností je DNA Z, kterou mají některé typy virů. Tvoří ji levotočivá šroubovice, v níž na jednu otočku připadá 12 párů bází.
Terciární a kvartérní struktura
V rámci terciární struktury se stáčí dvoušroubovice do tzv. super[[[Biochemie:Bílkoviny#Struktura_a_vlastnosti_protein.C5.AF|helixu]]. Tedy dvoušroubovise DNA se stačí do další šroubovice. Tento superhelix se pak navazuje na histony (druh proteinů), čímž dochází ke stabilizaci sekundární struktury. Tímto se ale již tvoří kvartérní struktura, která bývá označována jako nuklozóm, který se stáčí v solenoid a ten pak v určité fázi dělení buňky tvoří tvz. chromosom, což je kondenzovaná DNA. Ve fázi buňky, kdy neprobíhá dělení je chromosom rozvolněn do chromatinu.
RNA
Prozatím jsme se bavili především o nositelce genetické informace. Teď přišla řada i na RNA. Ta se od DNA liší jednou pyrimidonovou bází, sacharidem a uspořádáním v sekundární struktuře, kde je tvořena většinou pouze jedním vláknem. RNA můžeme rozdělit na tři typy.
mRNA tedy messenger RNA, neboli informační. Přenáší informaci (sled bazí) pro syntézu bílkovin o pořadí aminokyselin z jádra k místu proteosyntézy.
rRNA, tedy ribozomální RNA. Tvoří stavební složku ribozomálních podjednotek, strukturní kostra ribozómů (to jsou organely, kde probíhá syntéza bílkovin). Vyskytuje se několik velikostně i strukturně odlišných typů. Dá se říci, že funguje jako katalyzátor proteosyntézy.
tRNA, tedy transferová RNA, přenosová. Přináší aminokyseliny na proteosyntetický aparát buňky, do ribozómů. Pro každou aminokyselinu existuje alespoň 1 tRNA (je jich asi 60). Říká se o ní, že má strukturu jetelového listu, podle podobnosti jetelového listu s nákresem smyček tRNA, ale reálně je to spíše podobné písmenu L. Je relativně malá (73 až 93 nukleotidů). Na jejím řetězci rozeznáváme 3 útvary, v nichž nejsou báze spojeny vodíkovými můstky. Těmto útvarům říkáme smyčky. Nejdůležitějším je antikodonová smyčka nebo jen antikodón, který se váže na kodón mRNA. Kodón se nazýávájí tři báze mRNA, které kódují jednu aminokyselinu. I tato vazba probíhá na základě komplementarity bazí.
Dalšími smyčkami jsou D a T-smyčka, které byly takto pojmenovány po minoritních bazích, které se v nich vyskytují. Právě přítomnost těchto bazí způsobila, že nedochází k tvorbě H můstků. I zde rozlišujeme 3´ konec a 5´ konec. Právě na 3´ konec se pak navazuje daná aminokyselina, kterou má tRNA transportovat. Na danou bázi na 3´konci je aminokyselina navázána esterovou vazbou, kterou umožňují OH skupina na bázi a COOH skupina na aminokyselině.
Genová exprese
Replikace
Replikace je proces, při kterém dochází ke zdvojení dvou šroubovice DNA. Obě vlákna se od sebe oddělí a poté se ke každému doplní nové vlákno na základě komplementarity bází. Celý proces replikace začínají iniciační proteiny v místech, které se nazývají replikační počátky. Replikační počátky se v průběhu replikace zvětšují za vzniku tzv. replikačních vidliček. V replikačních vidličkách jsou navázány proteiny replikačního aparátu, které se pohybují ve směru replikace a rozvíjejí dvoušroubovicovou strukturu za současné syntézy nového řetězce. V jednom replikačním počátku se vytvoří dvě replikační vidličky, které se pohybují směrem od sebe, a proto je tato replikace nazývána obousměrná.
Nejdůležitějším enzymem je DNA-polymerasa, která syntetizuje nové vlákno DNA podle původního řetězce. Tento enzym katalyzuje připojování nukleotidů na 3'-konec rostoucího řetězce DNA za vzniku fosfodiesterové vazby mezi 3'-OH skupinou řetězce a 5'-fosfátovou skupinou přidávaného nukleotidu. DNA je syntetizována ve směru 5' konce nově syntetizovaného řetězce směrem ke 3' konci.
Nukleotidy vstupují do reakce jako energeticky bohaté nukleosidtrifosfáty (např. ATP,GTP…) a dodávají energii polymerizační reakci. DNA-polymerasa se neoodděluje od DNA po každém přidání nukleotidu, ale zůstává navázána na DNA a během polymerace se podél ní pohybuje. DNA-polymerasa je schopna syntetizovat nové vlákno pouze prodlužováním 3'-konce DNA.
V replikační vidličce nastává problém, protože původní dvoušroubovice se skládá ze dvou antiparalelních řetězců (je asymetrická).
Jeden nový řetězec je v replikační vidličce syntetizována podle templátu ve směru 3' → 5'. (Vzniká 5' → 3' řetězec). Druhý nový řetězec je v replikační vidličce syntetizován podle templátu ve směru 5' → 3'. Neexistuje DNA-polymerasa, která by dokázala prodlužovat 5'-konec DNA. Tudíž v tomto směru roste diskontinuálně tzn., že jsou ve směru 5' → 3' syntetizovány krátké úseky DNA (okazakiho fragmenty), které jsou následně spojovány v kontinuální řetězec. Řetězec, který je tvořen kontinuálně, se nazývá vedoucí řetězec. Řetězec, který je tvořen diskontinuálně, se nazývá opožďující se nebo váznoucí řetězec.
Před přidáním nového nukleotidu do řetězce, DNA-polymerasa zkontroluje, zda se předcházející nukleotid správně páruje s nukleotidem v templátu. Pokud ANO – přidá další nukleotid. Pokud NE – odstraní nepárující se nukleotid rozštěpením fosfodiesterové vazby a přidá jiný nukleotid. Proto DNA-polymerasa je velice přesně párující enzym, který udělá průměrně jednu chybu na 107 zreplikovaných párů bází.
DNA-polymerasa neumí začít syntetizovat nové vlákno. Existuje jiný enzym - primasa, která dokáže spojit dva volné nukleotidy. (Začátek syntézy nového vlákna podle jednořetězcové DNA.) Primasa nesyntetizuje DNA, ale krátké úseky RNA majících cca 10 nukleotidů. Tyto úseky se párují na základě komplementarity s templátovým řetězcem a poskytují 3'-konec pro DNA polymerasu. Slouží tedy jako primer (=startér) pro syntézu DNA. Opožďující řetězec je tvořen mnoha oddělenými úseky tzv. Okazakiho fragmenty. Na vytvoření souvislého vlákna DNA z Okazakiho fragmentů jsou třeba tři enzymy: • Nukleasa, která odstraňuje RNA primery
• Opravná DNA-polymerasa, která nahrazuje RNA primery DNA
• DNA-ligasa, která pospojí všechny úseky dohromady
Replikace DNA tedy vyžaduje spolupráci několika druhů enzymů. Replikační aparát umožňuje vznik a posun replikační vidličky a syntézu nové DNA. K jmenovaným enzymům patří ještě například helikasa, která rozvíjí dvoušroubovicovou strukturu.
Transkripce
Transkripce je prvním krokem genové exprese. Dochází při ní k přenosu genetické informace na mRNA. Jestliže buňka potřebuje nějaký konkrétní protein, je nukleotidová sekvence v patřičné oblasti dlouhé molekuly DNA v chromosomu nejprve zkopírována do mRNA. Tato RNA je přímo využívána jako templát (předloha, matrice) pro tvorbu proteinů. Transkripce začíná rozvolňováním krátkého úseku dvoušroubovice DNA, jeden z řetězců pak slouží jako templát pro syntézu RNA. Ribonukleotidová sekvence RNA je určena komplementárním párováním bází.
Jestliže se volný ribonukleotid páruje s deoxyribonukleotidem v templátové DNA, je tento ribonukleotid kovalentně připojen fosfodiesterovou vazbou k rostoucímu řetězci RNA v enzymově katalyzované reakci.
Řetězec RNA vzniká transkripcí a nazývá se tedy transkript. Transkript je prodlužován a je komplementární k templátovému řetězci DNA. Hned za místem, kde byl přidán ribonukleotid, dochází k obnovení dvoušroubovicové struktury DNA a vytěsnění vlákna RNA. Právě proto jsou molekuly mRNA jednovláknové.
Enzym RNA polymeráza katalyzuje připojování nukleotidů na 3'-konec rostoucího řetězce RNA za vzniku fosfodiesterové vazby mezi 3'-OH skupinou řetězce a 5'-fosfátovou skupinou přidávaného nukleotidu. RNA je syntetizována ve směru 5' → 3'. Pro syntézu RNA je využívána energie vznikající hydrolýzou ribonukleosidtrifosfátu (ATP, UTP, GTP a CTP).
DNA je uzavřena v jádře, ale ribosomy se nacházejí v cytoplasmě. mRNA musí být transportována z jádra do cytoplasmy malými jadernými póry. Před opuštěním z jádra však mRNA podléhá posttranskripčním úpravám. Transkripcí vzniká nejprve primární transkript (Pre-mRNA) neboli heterogenní jaderná RNA (hnRNA), která se dále upravuje. Upravená mRNA je transportována do cytoplasmy a tam překládána na proteiny (translace).
Eukaryotní DNA obsahuje kromě kódujících sekvencí (tzv. exony) i nekódující sekvence (tzv. introny). Introny nejsou překládány do proteinů. Celá DNA včetně exonů i intronů je transkribována do mRNA (přesněji do Pre-mRNA). Introny jsou odstraňovány enzymy (tzv. sestřihové enzymy) a exony jsou spojeny dohromady. Tento krok se nazývá sestřih (anglicky RNA splicing).
Translace
Translace je druhým krokem exprese genu. Dochází při ní k přepisu informace pomocí tRNA, nesené mRNA, čímž vzniká chtěný protein. Probíhá za katalytické účasti rRNA. Jakmile vznikne funkční mRNA, informace v ní obsažená může být ihned použita pro syntézu proteinu. Pravidla, kterými se řídí prostřednictvím mRNA přenos z nukleotidové sekvence DNA do aminokyselinové sekvence, jsou definovaná jako genetický kód. Sekvence nukleotidů mRNA je čtena jako trojice. Každá skupina tří nukletidů se nazývá kodon.
Dohromady lze vytvořit 64 kombinací trojic nukleotidů. K některým aminokyselinám přísluší i několik tripletů, ale naopak jednomu tripletu přísluší nanejvýš jedna aminokyselina. V genetickém kódu platí konvence, že 5'-konec nukleotidové sekvence mRNA je zapisován vlevo!
Pro syntézu jsou důležité dva typy kodónů. Start kodón započíná celou translaci, stop-kodón ji ukončuje. Kodony v mRNA nerozpoznávají přímo aminokyseliny, které specifikují. Translace mRNA do proteinu závisí na tRNA (transferová RNA), která je schopna jednou částí molekuly rozpoznat a spárovat se s kodonem v mRNA a jinou částí vázat aminokyselinu.
Jedna s částí tRNA se nazývá antikodon, což jsou tři nukleotidy komplementární ke kodonu v mRNA. Další důležitou oblastí je 3'-konec (vždy končí sekvencí CCA), na který je navázána příslušná aminokyselina.
Rozpoznání a připojení správné aminokyseliny je funkcí enzymů nazývaných aminoacyl-tRNA-syntetasy. Reakce katalyzovaná aminoacyl-tRNA-syntetasou vyžaduje dodání energie hydrolýzou ATP. Při této reakci vzniká vysokoenergetická (makroergní) vazba mezi tRNA a aminokyselinou. Tato energie je později využita pro tvorbu kovalentní vazby mezi rostoucím polypeptidovým řetězcem a nově navázanou aminokyselinou.
Jak již bylo řečeno, translace probíhá na ribozómech. Ribosom obsahuje čtyři vazebná místa pro molekuly RNA: jedno pro mRNA a tři pro tRNA (E-místo, A-místo, P-místo). Každý ribosom je tvořen z velké a malé podjednotky. Malá podjednotka zodpovídá za nasednutí tRNA na kodon mRNA. Velká podjednotka katalyzuje vznik peptidové vazby mezi aminokyselinou a polypeptidovým řetězcem.
Obě podjednotky se spojují na molekule mRNA obvykle blízko jejího 5'-konce a zahajují syntézu proteinu. Ribosom se pohybuje podél mRNA, překládá nukleotidovou sekvenci do aminokyselinové za použití tRNA a po dosyntetizování proteinu se obě jednotky opět oddělí.
Translace začíná na iniciačním kodonu AUG a pro iniciaci je třeba iniciační tRNA, která má na sobě vázaný methionin (u bakterií formyl-methionin). U eukaryot je iniciační tRNA s navázaným methioninem připojená k malé ribosomální jednotce za asistence několika tzv. iniciačních faktorů.
Po navázání iniciační tRNA se malá podjednotka váže na 5'-konec mRNA a začne se pohybovat podél mRNA ve směru 5' → 3' a hledat první kodon AUG, který je rozpoznán antikodonem iniciační tRNA. Po rozpoznání iniciačního kodonu se od malé ribosomální podjednotky odpoutá několik iniciačních faktorů, což umožní připojení velké ribosomální podjednotky. Iniciační tRNA se váže rovnou do P-místa, proto prodlužování řetězce může ihned začít navázáním druhé tRNA s aminokyselinou do A-místa.
Při proteosyntéze je neustále opakován tříkrokový cyklus. V prvním kroku je aminoacyl-tRNA navázána do A-místa. Ve druhém kroku dochází ke vzniku peptidové vazby mezi prodlužujícím se řetězcem a přicházející aminokyselinou. Ve třetím kroku se ribosom posune o 3 nukleotidy podél mRNA. tRNA bez navázané aminokyseliny se uvolní z E-místa a tRNA z A-místa se přesene do P-místa. Do volného A-místa se může okamžitě vázat další tRNA s připojenou aminokyselinou.
Poté dochází k tzv. elongaci translace, tedy prodlužováním řetězce aminokyselin. mRNA je překládána ve směru 5' → 3' a nejprve vzniká N-konec proteinu. Celý cyklus všech tří kroků je opakován při každém předávání nové aminokyseliny do polypeptidového řetězce, dokud ribosom nenarazí na stop-kodon. Polypeptidový řetězec roste směrem od N-konce k C-konci.
Translace je ukončena tzv. terminací. Konec proteinu je signalizován přítomností jednoho ze tří terminačních neboli stop kodonů (UAA, UAG nebo UGA). Těmto kodonům není přiřazená žádná aminokyselina. Místo tRNA se na stop kodon v A-místě vážou tzv. terminační faktory, které mění aktivitu peptidyltransferasy (ta spojuje aminokyseliny dohromady) tak, že místo aminokyseliny použije molekulu vody pro uvolnění karboxylového konce hotového polypeptidového řetězce z tRNA v P-místě. Poté již může dojít k uvolňení proteinu do cytoplasmy.
Po skončení proteosyntesy je mRNA odpojena od ribosomu a dojde k disociaci obou podjednotek ribosomu, které se mohou navázat na jinou molekulu mRNA a začít novou transkripci.
Kódování jednotlivých aminokyselin:
